四重荧光定量RT-PCR研究新型甲型禽流感病毒H7N9

本研究旨在建立一种四重荧光定量RT-PCR方法，用于检测和区分新型甲型禽流感病毒H7N9。通过分析甲型禽流感病毒和H7N9亚型保守区基因序列，设计特异性引物和Taqman探针，实现了对M基因、H7基因、N9基因及内参RP基因的同时检测。研究分为方法学建立和临床应用两部分，验证了该方法的灵敏度、特异性和重复性，并在临床标本检测中显示出良好的应用前景。

新型甲型禽流感病毒H7N9自2013年在我国上海和安徽首次发现以来，引起了全球关注。H7N9禽流感是由禽H7N9亚型引起的急性呼吸道传染病，具有较高的病死率。目前，实验室检测H7N9病毒感染的方法包括病毒培养、血清学检测和分子生物学检测等。其中，病毒培养作为诊断的 金标准 ，但存在敏感性及特异性较低的问题。因此，本研究建立了一种四重荧光定量RT-PCR方法，以提高检测的灵敏度和特异性。

实验方法

本研究通过对甲型禽流感病毒H7N9亚型保守区基因序列的分析，设计了高度特异性的引物和Taqman探针。采用一步法，实现了对M基因、H7基因、N9基因及内参RP基因的同时检测。

实验仪器与耗材

• 实时荧光定量PCR仪
• 生物安全柜
• 二氧化碳培养箱
• 倒置相差显微镜
• 低温超速离心机
• 电热恒温水浴箱
• 超低温冰箱(-80℃)
• 移液器
• 旋涡混合器
• NanoDrop ND-2000核酸检测仪
• 一20℃低温冰箱
• 4℃低温冰箱
• 恒压恒流电泳仪表
• 垂直电泳槽

实验步骤

1. 从NCBI基因库下载甲型流感病毒H7N9亚型的相关基因序列，进行同源性比较，设计特异性引物和探针。

2. 合成各基因标准品片段，连接到质粒载体，进行转化和培养。

3. 提取质粒DNA，测定DNA浓度，确定DNA拷贝数作为标准品定量母液。

4. 优化四重荧光定量RT-PCR反应体系中引物和探针的浓度。

5. 进行灵敏度、特异性和重复性验证实验。

6. 对临床标本进行检测，与市售试剂盒方法结果进行比较。

实验结果

1. 四重荧光定量RT-PCR反应体系的灵敏度达到102copies/mL。

2. 特异性实验表明，除流感病毒外，其他21种呼吸道病原体检测结果均呈阴性。

3. 重复性实验显示，不同浓度核酸的检测ct值标准差在0.11～0.37之间，变异系数(CV)均低于1.62%。

4. 临床标本检测结果显示，痰液标本的阳性率和检测时间均高于咽拭子标本。

实验讨论及展望

所建立的四重荧光定量RT-PCR法具有检测快速、准确的特点，对临床上疑似甲型流感病毒感染的患者可提供早期明确诊断，并可区分高致病性H7N9亚型。该方法从疑似患者的咽拭子、痰液标本中都可以检测到病毒，但痰液标本的检测结果更加稳定、可靠。未来，该方法有望在临床推广应用，为H7N9禽流感的防控提供有力支持。