溶解性多糖单加氧酶在提升PET酶（PETase）对PET聚合物降解能力中的作用

来自 实验室仪器网

科研人员最近发表的一篇文章探讨了溶解多糖单加氧酶(LPMO)与聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的结合，将PET的疏水表面转化为亲水表面。随后用传统酯酶(PETases)进行处理，可提高产品释放率。

塑料的机械和化学特性（包括强度和惰性）使其成为全球多种应用中不可或缺的材料。然而，这些特性加上有限的回收利用，导致塑料在垃圾填埋场和自然环境中堆积。

一些生物已经适应利用塑料。例如，PET同化细菌Ideonella sakaiensis已经发展出代谢能力，可以利用这些材料作为能源。这种细菌会分泌PETase，这是一种分解PET中聚合物链的酶。

然而，许多真菌和细菌难以适应塑料基质的惰性和疏水性。LPMO酶能够通过强氧化机制裂解多糖链。鉴于PET和多糖的性质非常相似，本研究考察了LPMO通过类似的氧化裂解机制增强PETase对PET的作用的潜力。

将PET瓶、高密度聚乙烯和聚丙烯的试样（~0.6×0.4厘米）与磷酸膨胀纤维素(PASC)基质上的AfLPMO9A发生反应。随后，按照“检测LPMO产品”中的说明检测纤维素寡糖。

使用X射线光电子能谱（XPS）和原子力显微镜（AFM）分析了塑料试样上的LPMO沉积情况。使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-ToFMS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）和高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测（HPAEC-PAD）检测LPMO产物。

通过使用PET粉末作为底物的顺序和同时酶测定来评估AfLPMO9A和IsPETase之间的相互作用。在顺序测定中，用AfLPMO9A预处理PET，用Milli-Q水或十二烷基硫酸钠清洗残留底物。然后将清洗过的残留底物与IsPETase发生反应。

在同步测定中，AfLPMO9A和IsPETase同时加入，与PET发生反应。通过高效液相色谱(HPLC)测定IsPETase释放的单(2-羟乙基)-对苯二甲酸酯(MHET)、对苯二甲酸(TPA)和双(2-羟乙基)-对苯二甲酸酯(BHET)的浓度。仅与IsPETase的反应作为同步和顺序测定的对照。

使用分光光度计测量与AfLPMO9A孵育后剩余的可溶性部分，间接估算与PET结合的蛋白质。还使用Chimera27中的Kyte-Doolittle量表计算了不同样品的疏水性平均值。最后，在5%显著性水平下，通过ANOVA和Tukey检验对数据进行统计分析。

与仅向PET中添加IsPETase相比，向PET中添加AfLPMO9A和IsPETase的组合溶液会降低酯酶活性。因此，LPMO和/或抗坏血酸可以通过未定义的氧化还原化学降解PETase，突显了在没有天然底物的情况下LPMO产生的活性氧物质的有害影响。

同时向PET中添加CuSO4和IsPETase会导致MHET和TPA产量略有增加。然而，抗坏血酸+CuSO4和抗坏血酸+CuSO4+H2O2的组合分别使MHET和TPA释放量减少了70%和100%。同样，同时向PET中添加AfLPMO9A和IsPETase也不会增强IsPETase的活性。

相比之下，用AfLPMO9A对研磨的PET瓶进行预处理，然后进行清洗和超声处理以去除残留的LPMO，然后应用IsPETase，可使MHET和TPA的释放增加24–64%。

在LPMO处理之前和之后对PET进行MALDI-ToFMS分析，未检测到直接归因于LPMO作用的产物。此外，当AfLPMO9A反应的上清液与IsPETase一起孵育时，HPLC无法检测到BHET、MHET或TPA。然而，对AfLPMO9A与研磨PET反应的上清液进行ESI-MS分析，发现了一种可溶产物，初步鉴定为D-木糖酸。

当研磨PET与AfLPMO9A以及已知底物PASC反应时，纤维寡糖的生成没有显著差异。这表明研磨PET与催化活性AfLPMO9A之间的相互作用很小或不存在。XPS在PET表面检测到的蛋白质可能是样品中存在的变性LPMO蛋白，它仍然粘附在表面上，即使经过水洗和超声处理也无法去除。

研究人员没有发现用AfLPMO9A处理PET后产生氧化产物的证据。XPS和AFM数据（包括对催化失活的AfLPMO9A突变体的分析）表明，在LPMO预处理后观察到的PETase活性增强可能是由于疏水蛋白效应。在这种现象中，LPMO与PET表面结合并促进PETase向聚合物的募集，从而改善它们与底物的相互作用。

LPMO的疏水蛋白效应有助于通过生物技术方法增强PET上PETase的活性。然而，研究人员建议进一步研究生物分子与聚乙烯和聚丙烯等合成聚合物的相互作用，以扩大类似策略的适用性。这可以支持开发更广泛的合成聚合物的生物修复方法。

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